10.10.2017

Прочная кутикула жуков-долгоносиков развивается при участии симбиотической бактерии

Японские биологи изучили симбионтов жуков-долгоносиков — бактерий нардонелл. Как оказалось, эти древние симбионты утратили практически все гены, кроме тех, которые нужны для воспроизведения клеток и синтеза аминокислоты тирозина. Именно производство этого вещества, необходимого для нормального развития кутикулы, является их основной функцией в организме жуков. В отсутствие достаточного количества бактерий жуки рождаются с недоразвитыми надкрыльями. Возможно, именно этот симбиоз позволил жукам-долгоносикам развить очень прочную кутикулу, что, в свою очередь, могло способствовать их эволюционному успеху.

В последние десятилетия копится всё больше данных о том, что бактериальные симбионты играют важнейшую роль в формировании признаков многоклеточных организмов, выполняя часть нужных хозяевам функций и влияя на развитие отдельных органов и поведения. Многие из этих симбионтов не способны существовать самостоятельно и значительно упростили свои геномы за десятки и сотни миллионов лет жизни в хозяевах. По-видимому, это «переходные звенья» от свободноживущих организмов к органеллам, происходящим от симбионтов, — таким, как митохондрии и хлоропласты.

Один из примеров такого симбиоза — бактерия Nardonella и жуки-долгоносики. Жуки (Жесткокрылые) сами по себе — самый богатый видами отряд насекомых (известна история, как британский биолог Джон Холдейн, один из авторов синтетической теории эволюции, в ответ на вопрос о том, какое свойство Творца наиболее ярко проявилось в Природе, сказал, что это «необычайная любовь к жукам»). А среди жуков одни из самых многочисленных — долгоносики (семейство Curculionidae). По числу видов они уступают только жукам-стафилинидам. Но если брать в расчет все надсемейство Куркулионоидных (Curculionoidea), к которому относятся долгоносики, то это будет самая богатая видами группа жуков (около 70 000 описанных видов, и при этом каждый год описывают значительное число новых!).

Симбиотическая гамма-протеобактерия Nardonella живет во многих долгоносиках. По-видимому, этот симбиоз возник более 100 миллионов лет назад. Однако роль этой бактерии в жизни жуков до сих пор не была известна.

Большая группа японских биологов изучила геном и биологические функции нардонеллы у четырех видов обитающих на острове Окинава жуков-долгоносиков (рис. 1) и выяснила, что мы имеем очередной пример сверхупрощенного симбионта, служащего выполнению одной нужной хозяину функции, а именно — синтезу аминокислоты тирозина, важной для формирования прочной кутикулы.

Нардонелла обитает у личинок жуков внутри специального органа — бактериома, расположенного в месте соединения передней и средней кишки, а у взрослых самок — в яичниках и развивающихся яйцах (рис. 2).

Размер генома нардонелл оказался одним из самых маленьких среди известных бактериальных эндосимбионтов: у разных штаммов, полученных из выращенных в лаборатории жуков разных видов, он имел от 0,2 до 0,23 миллионов пар оснований (рис. 1), с 196–226 предполагаемыми белок-кодирующими открытыми рамками считывания. Кроме основной кольцевой хромосомы у симбионтов одного из видов жуков, Sipalinus gigas, также нашли маленькую плазмиду размером 2,1 тысячи пар оснований, несущую всего два гена. Несмотря на малый размер, геном нардонелл содержит полный набор генов, отвечающих за репликацию, транскрипцию и трансляцию, а также за синтез пептидогликанов, необходимых для построения клеточной стенки бактерии. Кроме этих жизненно важных функций, единственный другой биохимический путь, целиком представленный в геноме этих симбионтов, — это синтез тирозина. В их геноме есть еще лишь несколько генов, участвующих в иных биохимических процессах.

Таким образом, нардонеллы представляют собой высокоспециализированные самовоспроизводящиеся «машины» для синтеза тирозина. Это подтвердили и опыты с культурами бактериоцитов (клеток бактериомов) жука Pachyrynchus infernalis (последующие опыты проводились также только с нардонеллами из этого жука), выращиваемыми в среде с помеченным радиоактивным азотом глутамином (эта аминокислота использовалась как источник аминогрупп для синтеза других аминокислот в клетках бактерий и жуков) — впоследствии он обнаруживался почти исключительно в тирозине (рис. 3). Выращивание личинок жуков при повышенной температуре (30 °C) практически полностью убило нардонелл в бактериомах и существенно снизило включение радиоактивного азота в тирозин. Таким образом, синтез этой аминокислоты – действительно в основном результат деятельности симбиотических бактерий.

Однако нагревание слишком хорошо убивало бактерий: ни одна из участвовавших в этом опыте личинок не смогла сформироваться во взрослую особь. Поэтому далее ученые использовали менее радикальный способ уменьшения зараженности жуков нардонеллой. Они добавляли в специально разработанный корм на основе агара небольшое количество антибиотика рифампицина. В отсутствие антибиотика на этом корме жуки развивались нормально и их бактериомы были наполнены клетками симбионтов (рис. 4) — всё было так же, как и на стандартной диете из топинамбура. Личинки, которым скармливали антибиотик, также росли, но их бактериомы содержали существенно меньше бактериальных клеток. Интересно, что у куколок и взрослых особей бактерии восстанавливали свою численность — видимо, после того, как личинки переставали питаться перед окукливанием, выжившие нардонеллы усиленно размножались. Личинки, питающиеся антибиотиком, выживали лучше контрольных — в отличие от последующих стадий! Они были крупнее и потом дольше находились в стадии куколки — это говорит о том, что рифампицин на ранних стадиях развития шел жукам на пользу. Авторы связывают это с тем, что он не давал другим бактериям заражать корм, что часто случалось в контроле.

Уменьшение числа бактериальных симбионтов не только приводило к возросшей смертности на поздних стадиях развития — взрослые жуки Pachyrhachys infernalis, выросшие на диете с антибиотиками, имели много аномалий в развитии надкрылий (рис. 5). Надкрылья у них становились красноватыми, деформированными и мягкими (при этом в норме долгоносики — одни из самых «твердых» жуков; по моему собственному опыту, проткнуть их энтомологической булавкой бывает весьма трудно). Красноватый цвет — тоже свидетельство недоразвития надкрылий, так как с течением времени красноватые жуки постепенно чернели (при этом у особей, родившихся красными, была повышенная смертность). Измерения показали, что, вопреки ожиданиям, в среднем модуль упругости надкрылий (количественная мера их прочности) не различался у контрольных и питавшихся антибиотиком жуков — так что их мягкость, видимо, была связана с меньшей толщиной (после вылупления надкрылья утолщаются, но у особей из контрольной группы достигают большей толщины). Все вместе эти данные указывают, что нехватка симбиотических бактерий приводит у долгоносиков к недоразвитию надкрылий.

Тирозин и его производное ДОФА (L-диоксифенилаланин) действительно играют важную роль в склеротизации и пигментации надкрылий (см. M. Y. Noh et al., 2016. Cuticle formation and pigmentation in beetles), запуская соответствующий каскад биохимических реакций. И у вскормленных на антибиотик-содержащей диете личинок поздних возрастов, как и у появившихся из них куколок, концентрация этих веществ была ожидаемо ниже, чем у контрольных особей, имевших достаточное количество бактерий.

Однако, хотя геном нардонеллы и позволяет назвать их «машиной по производству тирозина», эта бактерия лишена генов фермента, катализующего последнюю стадию синтеза этой аминокислоты, — тирозин-трансаминазу. Ученые предположили, что завершение синтеза контролируется геномом самого жука. Они проверили его транскриптом на наличие РНК, кодирующих способные к выполнению этой функции белки, известные у других насекомых, — глутамат-оксалоацетат трансаминазы 1 и 2 (GOT1 и GOT2) и тирозин-аминотрасферазу (TAT). Выяснилось, что у жуков экспрессируются три копии гена GOT1 (их обозначили буквами А, В и С), две копии гена GOT2 (А и В) и одна копия гена TAT. РНК последнего фермента было обнаружено очень мало, а вот РНК генов GOT1A и GOT2A оказались основными транскриптами, обнаруживаемыми в клетках бактериома.

Чтобы выяснить, как отключение жучиных генов трансаминаз влияет на развитие личинок, ученые использовали РНК-интерференцию — подавление экспрессии гена путем введения в организм двухцепочечных РНК (это имитирует вирусную инфекцию и включает один из механизмов иммунитета). Одновременное введение двухцепочечных РНК GOT1A, GOT2A и TAT в культуру бактериоцитов существенно снижало экспрессию первых двух генов (экспрессия TAT и так была очень низкой — настолько, что ее потенциальное снижение было за пределами возможностей измерения) и продукцию тирозина. При этом ни одна из подвергшихся такой же процедуре особей жуков не вылупилась из куколки — максимум, они могли сформировать взрослую особь с несклеротизованной кутикулой, которая оставалась внутри оболочки куколки. Если же с помощью РНК-интерференции подавляли только экспрессию гена GOT2A, то жуки выживали, но у них были такие же аномалии развития надкрыльев, как у тех, у кого подавляли активность бактериальных симбионтов.

Таким образом, жуки-долгоносики используют нардонелл для производства необходимого им для образования кутикулы тирозина, сохраняя контроль над этим процессом. Похожая картина известна и в других подобных симбиотических системах. Так, геном бактериального симбионта тлей Buchnera тоже содержит гены для всех стадий синтеза пяти производимых ими аминокислот, кроме последних, контролируемых геномом насекомого.

Возможно, симбиоз с нардонеллой сыграл важную роль в эволюционном успехе долгоносиков (напомним, что это второе по числу видов семейство жуков), ведь очень прочная кутикула защищает их от хищников, механических воздействий и высыхания. Недавние исследования показали, что кутикула долгоносиков отличается тесно переплетенными участками экзо- и эндокутикулы (см. Покровы тела и их производные) — заманчиво предположить, что симбионты ответственны и за это, однако пока никаких доказательств нет.

За более чем 100 миллионов лет совместной жизни нардонеллы утратили способность к самостоятельному существованию: они даже не заражают новых особей, переходя вертикально, от матери к потомкам (это подтверждается и строгим совпадением филогенетических деревьев долгоносиков и нардонелл — расхождение линий у одних совпадает с расхождением линий у других). Однако такое сверхупрощение приводит к тому, что нардонеллы относительно часто могут утрачиваться: известно много групп долгоносиков, лишенных этих бактерий. Видимо, этому может способствовать переход жуков на богатую тирозином пищу или заражение другими тирозин-продуцирующими бактериями (а таковых довольно много). Вероятно, последний вариант случился в эволюции долгоносиков рода Sitophilus, у которых нардонеллы замещены другими гамма-протеобактериями, Sodalis pierantonius. Эти симбионты обладают большим геномом (4,5 миллиона пар оснований), в котором закодированы многие биологические функции, хотя и у них обнаруживаются признаки вырождения: в геноме много псевдогенов и инсерционных последовательностей (см. IS-элементы). Sodalis pierantonius выполняет множество функций в развитии своего хозяина, однако, по-видимому, именно синтез тирозина и упрочение кутикулы позволило этой бактерии заместить нардонеллу и сейчас она движется по тому же пути упрощения, только находится на более ранней стадии.

Бактерии Nardonella и жуки-долгоносики являют собой еще один пример того, насколько тесным может быть симбиоз, в котором один из организмов фактически утрачивает самостоятельность. Однако зависимость оказывается взаимной: как нардонеллы не выживают вне организма жука, так и жуки без бактерий не могут завершить свое индивидуальное развитие. Конечно, жуки всё же более самостоятельны — об этом свидетельствуют случаи утраты или замещения симбионтов. Но вряд ли они когда-либо совсем избавятся от них. Скорее, можно ожидать, что через долгое время нардонеллы утратят даже способность к самостоятельному размножению и превратятся в особые органеллы.

Источник: Hisashi Anbutsu, Minoru Moriyama, Naruo Nikoh, Takahiro Hosokawa, Ryo Futahashi, Masahiko Tanahashi, Xian-Ying Meng, Takashi Kuriwada, Naoki Mori, Kenshiro Oshima, Masahira Hattori, Manabu Fujie, Noriyuki Satoh, Taro Maeda, Shuji Shigenobu, Ryuichi Koga, and Takema Fukatsu. Small genome symbiont underlies cuticle hardness in beetles // PNAS. 2017. V. 114. P. 8381–8391. DOI: 10.1073/pnas.1712857114.

Сергей Лысенков

Источники:

1. elementy.ru